OMEGA-3 ET QUALITE: comment être sûr de sélectionner un DHA végétal de qualité supérieure?

Purification et conservation des souches

L’isolement des souches

Les échantillons prélevés en milieu naturel peuvent contenir une grande variété de micro-organismes. Le défi consiste à isoler et à purifier les meilleurs. Après une incubation à des températures similaires à celles des sites de récolte, on a constaté que plusieurs types de colonies se développaient. Certaines étaient les Thraustochytriaceae (que nous recherchions), mais beaucoup d’autres étaient des microoragnismes de différents types tels que des champignons ou des bactéries.

Si les Thraustochytriaceae se développent rapidement et sont donc facile à isoler, certains des contaminants présents dans les échantillons croissent aussi rapidement. Ceci rend complexe la tâche d’isolement et d’axénisation[2]  des souches ciblés. L’étape d’isolement implique plusieurs techniques de sous-culture qui nous permettent de séparer les souches que nous voulons, de celles que nous ne voulons pas, et peut aller jusqu’à la séparation de cellules individuelles au microscope.

Plusieurs sous-cultures[1] successives ont dû être préparées sous un microscope stéréoscopique. Nous avons utilisé ces techniques de micromanipulation (et d’autres) pour isoler et purifier les souches qui nous intéressaient, jusqu’à ce que nous soyons sûrs que ce soit les seuls micro-organismes en développement. Ces techniques prennent des jours, voire des semaines, avant que d’obtenir des cultures exemptes de contaminants, appelées axéniques. A partir de là, les souches sont maintenues en utilisant la meilleure technique stérile pour garantir leur pureté et non contaminées par d’autres micro-organismes.

Identification génétique

L’inspection au microscope du cycle de vie de la souche et l’analyse génétique ont ensuite confirmé l’identité de chaque isolat[2].

Afin de confirmer l’identité précise des souches axénisées, le séquençage de plusieurs gènes de référence clés a été effectué. Ces gènes clés sont présents dans presque toutes les cellules et varient selon les espèces (ni trop, ni trop peu) pour qu’on puisse les utiliser pour générer des arbres généalogiques d’organes. Par comparaison, avec les mêmes séquences génétiques des autres organismes contenues dans des bases de données telles que le NCBI (National Center for Biotechnology Information), nous avons pu identifier précisément le genre et l’espèce de chaque isolat parmi les espèces de microalgues collectées avec un certain nombre de bons candidats dont Schizochytrium sp., que nous avions ciblé.

Stockage de la collection de cultures de Fermentalg

Les souches axénisées ont été rapportées à l’équipe en charge de la collection de cultures chez Fermentalg. . Leur objectif est de préserver les nouvelles souches fraîchement extraites de leur milieu naturel, afin d’éviter les changements aléatoires de croissance ou de composition qui peuvent parfois être observés si les souches commencent à s’adapter à l’environnement de laboratoire, qui peut être sensiblement différent de la nature.

Le stockage en cryopréservation (à -150°C) est un moyen de bloquer complètement le métabolisme et d’empêcher ainsi toute modification de la souche, puisque celle-ci ne se produit que lorsque les cellules se divisent et se développent. Elle présente également l’avantage de réduire le besoin de sous-culture et le risque de recontamination. Le stockage par cryoconservation ne s’apparente pas à juste placer les cellules dans un congélateur. Un protocole doit être conçu, spécifique à chaque souche, à l’aide d’un congélateur programmable, qui contrôle la vitesse de baisse de la température.

Contrôle, caractérisation et développement des souches

 A cette étape, Fermentalg disposait d’un certain nombre de souches candidates pour la production de DHA, mais les capacités de croissance et de biosynthèse étaient inconnues. L’étape suivante a donc consisté à tester différents environnements de croissance afin d’identifier les conditions optimales pour la production de DHA.

• Les caractéristiques trophiques[3] ont d’abord été étudiées dans des flacons Erlenmeyer exposés à la lumière ou maintenus dans l’obscurité, en examinant comment différentes sources de carbone organique, sources d’azote et autres macro et micro-éléments étaient utilisées et affectaient la production de DHA.
• La vitesse de croissance a également été mesurée et a fourni un point de comparaison entre chaque souche.
• L’analyse biochimique de la composition de la biomasse était essentielle pour comprendre les différentes souches de Schizochytrium sp. : analyse sur les lipides et les acides gras, mais aussi d’autres classes de molécules comme les pigments, les polysaccharides et les protéines.
• Le potentiel industriel de chaque souche pouvait alors être évalué sur la base des données relatives à la croissance, à la teneur en DHA et à l’accumulation de lipides; et de l’impact de ces données sur le processus de production et la qualité finale du produit.

Notre compréhension de la biologie de base de ces types d’organismes nous a permis d’encourager leur développement de manière à accroître leur aptitude à l’industrialisation. Nous avons affiné les conditions pour sélectionner naturellement les souches qui ont une croissance plus rapide et de meilleures propriétés de production d’oméga-3 que les souches initiales, en particulier les souches qui produisent des
proportions plus élevées de DHA dans leurs huiles.

[1] La sous-culture microbiologique consiste à prélever certains microbes d’un milieu de croissance et à les transplanter dans un milieu de croissance frais

[2] Colonie de micro-organismes isolés d’autres organismes qui peuvent être présents dans le milieu de croissance

[3] Les conditions de nutrition et de développement des organismes